Очоа, Северо: биография

Я с удовольствием вспоминаю тот период сотрудничества с Эрни Роуз. Мы успешно преодолели испытательный срок, и под Рождество Северо Очоа решил доверить нам «проект своей мечты» — окислительное фосфорилирование. Эрни Роуз решил исследовать его на крысиных митохондриях. Так как он был восхищён работой Пола Бойера и Милреда Кона по изотопному обмену 18О, он захотел применить метод для своего исследования. Я же не хотела убивать крыс и задумала изучать процесс на бактериях. Я решила, что, выбирая именно аэробные бактерии, как например, Azotobacter vinelandi, которые активно окисляют углеводы, я смогла бы лучше изолировать активную систему для синтеза ATP, совмещённого с окислением. Понимая, что было бы сложным выявить поглощение чистых PO4 в бактериальных экстрактах, загрязнённых фосфатами и различными реакциями, сопровождающимися их поглощением или выделением, я решила использовать реакцию обмена между PO4 и ATP (хорошо владея таковой после изучения ацетокиназы), как метода изоляции некоторых интересных новых фосфорилированных коэнзимов. Идея, кажущаяся теперь наивной, заключалась в том, что реакция, включающая растворимый коэнзим X, который бы фосфорилировался специфическим ферментом в течение синтеза ATP, была бы очень проста:

Разумеется, я наблюдала обмен между 32PO4 и двумя концевыми фосфат-группами ATP в растворе экстракта Azotobacter vinelandi и начала очистку белка, ответственного за обмен. В качестве субстрата я использовала продажный аморфный ATP. В течение этой работы, Сигма объявил об очень чистом кристаллическом производном ATP, которое они только что приготовили. Мне удалось получить немного этого вещества, и, к моему удивлению, я больше не наблюдала реакцию обмена с кристаллическим производным в присутствии частично очищенной мною фракции белка. Этот факт, однако, обрадовал нас с Северо Очоа, так как мы надеялись, что аморфный препарат содержит интересный кофактор. Я решила выделить фракцию из аморфного препарата, которая, при добавлении к кристаллическому ATP, возобновляла обмен. Каково же было моё удивление, когда хроматография идентифицировала это вещество как ADP. По сути, ATP был только меченый, так как аденилаткиназа всё ещё загрязняла белковую фракцию (известно, что очень сложно избавиться от следов аденилаткиназы). Я помнила об этом, когда рассказывала об этом открытии группе за ланчем. Никто мне не верил, и Северо Очоа задел меня, сказав, что это невозможно, однако, затем раскаялся в этом, и, придя в лабораторию, я легко смогла убедить его, что истинный субстрат в реакции обмена — ADP. Он был потрясён, так как никто не знал фермент, способный катализировать такой обмен, и одобрил моё стремление попытаться понять, что в этой реакции ответственно за него. Вскоре я обнаружила, что этот фермент не является специфическим для ADP, а катализирует обмен и с другими дифосфатными нуклеотидами (UDP, CDP, GDP и IDP).

Летом 1954 года Северо Очоа стал деканом Биохимического Факультета и переехал в новое здание через дорогу. Там было больше места, в подвале была опытная установка, управляемая Мортоном Шнайдером и Питером Лозиной; также там было удобнее работать с радиоактивными изотопами. Из группы ушли Сеймур Кауфман, Джо Штерн и Элис дель Кампильо, а Билл Якоби, Мартин Флавин и Чарльз Гилвард остались; новыми сотрудниками были Гегард Плаут и Энрико Кутоло. Здесь у нас было больше удобств для ланча, а также нас посещало большее количество людей. Настало ещё более деятельное и бодрое время. Но, после первого восторга от открытия новой реакции я провела несколько разочаровывающих надежды месяцев, пытаясь добиться хоть какого-либо прогресса. В течение этого времени Северо Очоа от всей души оказывал мне поддержку и одобрял меня в попытках дополнительно очистить фермент. Я проделала это, но всё равно не могла определить реакцию: это было, как если у вас есть белковый кристалл, но вы не можете опознать сам кристаллизующийся белок. Во время обмена выделялось немного фосфата, но это предписывалось остаткам загрязнения фосфатазой. Северо Очоа начинал впадать в уныние из-за того, что в это время Пинчот выделил различные фракции из Alcaligenes faecalis, которые, смешиваясь, катализировали поглощение чистых фосфатных групп, сопровождаемое электронным переносом. Он стал сомневаться в значении обмена и одобрил мою попытку воссоздать эксперимент Пинчота с экстрактом Azotobacter vinelandi. Я вспомнила, что Пинчот посещал нас и производил эксперименты в нашей лаборатории. Однако я не была готова к немедленному решению задачи. В особенности, я была в тупике из-за небольшого выделения фосфата, в то время как точно знала, что фермент хорошо очищен от фосфатазы, и решила выследить причину этого явления.