Очоа, Северо: биография
Было также несколько сообщений о том, что оксление пропионата включает в себя фиксацию CO2 и ведёт к образованию сукцината. Северо Очоа просит Мартина Флавина, присоединившегося к группе, исследовать этот процесс. Флавин, используя экстракт свиного сердца, обнаружил, что данный экстракт переводит пропионат в дикарбоновую кислоту, но кислота эта не сукциновая, а метилмалонат. Работа М. Флавина, Й. Казиро, Э. Леоне, П. Лэнгиэла, Р. Мацундера и других показывает, что пропионат сперва переходит в пропионил CoA карбоксилазу — фермент, содержащий биотин; затем метилмалонил CoA изомеризуется до A и B-форм. В-форма даёт сукцинил CoA из метилмалонилмутазы; мутаза — фермент В12. Пропионил CoA карбоксилаза, выкристаллизованная Казиро, карбоксилируется и переносит карбоксильную группу пропионилу CoA.
Интересный фермент цикла трикарбоновых кислот, открытый Кауфманом в шпинате, катализирует синтез ATF из ADF, Pi и сукцинила CoA. Сукцинил CoA был затем деацетилирован в сукцинат и CoA. Фермент был обозначен как фосфорилирующий фермент или P-фермент, а затем сукциниктиокеназа. P-фермент участвует в субстраном фосфорилировании, следующем за декарбоксилированем кетоглютарата в цикле Кребса. Этот фермент убедил Очоа вернуться к изучению окислительного фосфорилирования.
Полинуклеотидфосфорилаза
В 1955 году он вместе с аспиранткой Марианной Грюнберг-Манаго (уроженкой России, впоследствии известным биохимиком, работавшей во Франции) выделил из микроорганизма Azotobacter vinelandi новый фермент, который катализировал синтез in vitro сходной с РНК молекулы, состоящей из 4, 3, 2 и даже одного азотистого основания. Ферменту было дано название «полинуклеотидфосфорилаза». Тщательные эксперименты показали, что синтетический полирибонуклеотид напоминает собой натуральную РНК по размеру. Его молекулярная масса варьировала от 30000 до 1-2 х 106 Да. Были сходны и константы седиментации. Для проведения надежной реакции синтеза РНК требовался высокоочищенный фермент, для чего использовали хроматографию. Кроме того, для инициации синтеза необходимо было добавление в раствор небольшого количества олигомера — тогда происходит наращивание полимерной цепочки. При обработке синтезированного РНК-подобного полимера панкреатической рибонуклеазой получается смесь олигонуклеотидов такая же, как и при расщеплении натуральной РНК в сходных условиях. В опытах с гидролизом синтезированного полимера с помощью фосфодиэстеразы, выделенной из змеиного яда и ткани селезенки, было показано, что полученная экспериментально РНК представляет собой линейную цепочку, нуклеозидные единицы которой связаны 3,5’-фосфодиэфирными мостиками. Через два года Артур Корнберг выделил из кишечной палочки фермент ДНК-полимеразу и с его помощью осуществил синтез ДНК. В 1959 г. обоим ученым была вручена Нобелевская премия.
Генетический код
После открытия полинуклеотидфосфорилазы, в лаборатории Северо Очоа занимались, главным образом, двумя вещами: окислением пропионата, изучавшееся докторами, пришедшими после ухода Мартина Флавина, и, собственно, самой полинуклеотидфосфорилазой. Очоа работал с новым учёным из Японии — Санаи Ми — над реакцией синтеза, надеясь, что с дальнейшим очищением фермента выяснятся праймер или матричные ограничения. Фактически, это был единственный случай, когда протеолизирующийся фермент нуждался в праймере для синтеза полимера. Несмотря на то, что в дальнейшем эти исследования не оказались полезными в определении роли фермента in vivo, они принесли чрезвычайно большую пользу в синтезе многих полимеров. Таким образом, лаборатория Очоа была готова к экспериментам in vitro над генетическим кодом.
Общее представление об мРНК было сформулировано в 1960-е, и в 1961 году Ниренберг и Маттаи, на Международном Конгрессе по Биохимии в Москве, сообщили, что экстракт кишечной палочки переносит полиуридилат (poly U) в полифенилаланин. Это была самая будоражащая новость на конгрессе, после которой стало ясно, что открывается большое поле для экспериментов в изучении генетического кода. Между лабораторями Очоа и Ниренберга в следующие месяцы началась гонка по изучению эффекта, оказывающегося различными сополимерами на соединение аминокислот. Вычисляя статистическое построение триплетов в гетерополимерах, было возможно определиль их соотношение для большинства аминокислот. В работу были вовлечены Питер Ленгиэл, Джо Спейер, Венди Стэнли и Альберт Вабха, но Очоа лично проводил этот проект, и технические ресурсы факультета были полностью брошены на синтез как можно большего числа соединений, в которых нуждалась работа по декодированию.
